روش سریع با کارایی بالا برای تراریخته نمودن گیاه یونجه به منظور تظاهر ژن BANYULS (BAN)

پروآنتوسیانیدین‌ها (CTs:Condensed Tannins)، الیگومرهای فلاونوئیدی می‌باشند که تعدادی از آنها اثرات مفیدی روی سلامت حیوان و انسان دارند. توانایی پروآنتوسیانیدین‌ها در تشکیل کمپلکس با پروتئین‌ها سبب شده که تأثیر زیادی بر ارگانیسم‌های تجزیه‌کننده پروتئین و در نهایت کاهش خطر نفخ در حیوانات داشته باشند. آنتوسیانین‌ها نیزفلاونوئیدهایی هستند که در ایجاد رنگ قرمز، بنفش یا آبی در بذرها و گلها شرکت دارند. ژن BAN حاصل از گیاه Arabidopsis thaliana رمزگردان آنتوسیانیدین‌ردوکتاز (ANR) می‌باشد. این آنزیم آنتوسیانیدین‌ها را به 2,3-cis-flavan-3-ols( (+)-catechin ) که به‌عنوان واحد شروع کننده در تشکیل CT شناخته می‌شوند تبدیل می‌کند. انتقال این ژن به گیاه یونجه، به منظور القاء تولید CT در شاخ و برگ آن جهت استفادة بهینه از پروتئین‌های گیاه و کاهش خطر نفخ درحیوانات انجام شد. عمل تراریزش ریز نمونه‌های برگی حاصل از دو لاین یونجه چند ساله با نامهای Rgsy27 و ‍‍‍P1 که در حالت عادی دارای مقادیر ناچیزCT در شاخ و برگ می‌باشند توسط دو نژاد مختلف باکتری (LBA 4404 , EHA 105) Agrobacterium tumefaciens، حامل پلاسمید pBI121. BAN (ناقل دوتایی شامل ژن BAN) صورت گرفت. از ریز نمونه‌های برگی حاصل از لاین Rgsy27 بیش از 90 درصد تولید کالوسهای پیش جنین‌زا و از ریز نمونه‌های برگی حاصل از لاین P1 حدود 30 درصد تولیدکالوسهای پیش جنین‌زا تولید شد. در هردو لاین بیش از 65 درصد جنین‌های باززایی شده در مدت 2 ماه به گیاه کامل تبدیل شدند. کارایی تراریزش لاین‌هایRgsy 27 و P1 بستگی به نوع نژادهای Agrobacterium tumefaciens مورد استفاده داشت، به‌نحوی‌که لاین‌های تراریخته توسط ژن BAN با نژاد آگروباکتریوم LBA 4404 بهترین واکنش را نسبت به تولید گیاهان تراریخته نسبت به نژاد EHA 105 نشان دادند. تظاهر اکتوپیک ژن BAN در شاخ و برگ گیاه یونجه تراریخته باعث القاء تجمع CT شد که به راحتی از طریق بررسی شیمی بافتی قابل تشخیص بود. عدم فعالیت ژن BAN باعث افزایش مقدار رنگدانه قرمز شد. بنابراین این ژن به‌عنوان تنظیم‌کننده منفی در تولید رنگدانه‌ها می‌باشد. درصد CT در ماده خشک گیاهان تراریخته لاین‌های Rgsy27 و P1 به‌ترتیب 474/0 و 600/0 در مقایسه با 259/0 و 408/0 در گیاهان کنترل بود.